內(nei)容來源地QQ華夏酒報; 　β—葡(pu)萄(tao)(tao)糖苷酶(mei)又稱(cheng)β—D—葡(pu)萄(tao)(tao)糖苷葡(pu)萄(tao)(tao)糖水解(jie)(jie)酶(mei)，它可以水解(jie)(jie)糖鏈(lian)末(mo)端非還(huan)原(yuan)性的β—D—葡(pu)萄(tao)(tao)糖苷鍵。β—葡(pu)萄(tao)(tao)糖苷酶(mei)是纖維素酶(mei)的主要組成成分，直接(jie)影響著纖維素酶(mei)的降解(jie)(jie)能力。

　　此外(wai)，β—葡萄糖苷酶(mei)(mei)在(zai)(zai)食品行業中(zhong)也有著廣泛的(de)應用，如(ru)作為(wei)水果和(he)茶葉的(de)風(feng)味(wei)酶(mei)(mei)，水解(jie)大豆異(yi)黃酮(tong)甙元等。β—葡萄糖苷酶(mei)(mei)存在(zai)(zai)于(yu)(yu)自然界(jie)很多植物中(zhong)，也存在(zai)(zai)于(yu)(yu)酵母、曲霉屬(shu)、木霉屬(shu)及一些細菌中(zhong)。黑(hei)曲霉是公(gong)認安全的(de)微(wei)生物之一, 在(zai)(zai)纖維(wei)物質的(de)誘導下，黑(hei)曲霉可(ke)產生胞(bao)外(wai)β—葡萄糖苷酶(mei)(mei)。

　　筆者研究了黑曲霉固態發(fa)酵啤(pi)酒(jiu)糟產(chan)β—葡萄(tao)糖苷酶的(de)工藝條件，同時(shi)探討了β—葡萄(tao)糖苷酶合成的(de)動力學(xue)機(ji)制，望能為(wei)啤(pi)酒(jiu)糟的(de)再利用提供(gong)一定(ding)數據(ju)(ju)依據(ju)(ju)。

    　1 材料和方法
    　1.1 菌種
    　黑曲霉購于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。
    　1.2 試劑和設備
    　1.2.1 主要試劑
    　啤酒糟由蚌埠學院生物與食品工程系啤酒發酵實驗室提供；
    　水楊苷（進口分裝）、微晶纖維素（進口分裝）、羧甲基纖維素鈉（CMC）、 3， 5—二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚。
    　1.2.2 主要設備
    　752分(fen)光光度儀(yi)（上海菁華科技儀(yi)器有限(xian)公司）、DH Z—D冷凍恒溫(wen)振蕩器（江蘇太倉市(shi)實驗設備廠）、SFAT—8000固態發酵(jiao)罐（常州新區(qu)三(san)環生物工程成套設備有限(xian)公司）。

    　1.3 培養基
    　斜面培養基：PDA培養基；
    　發酵(jiao)培(pei)養基：啤酒糟5g置于500ml 三角瓶中，用基本(ben)培(pei)養液調初始含水量，121℃滅菌(jun)20min。

    　1.4 試驗方法
    　1.4.1 粗酶液的制備
    　黑曲霉在無菌條件下接入斜面培養基，30℃培養72h。每100ml  無菌水接入1環孢子配置種子懸浮液( 1.15×106 /ml )。按一定料液比將種子懸浮液接入滅菌后的發酵培養基中，培養96h。用100ml去離子水浸提培養基，攪拌1h，抽濾，在3000r/min條件下離心15min，收集上清液，即為粗酶液。
    　1.4.2 單因素分析
    　在其他條件不變的情況下，分別測定不同溫度、料液比和接種量對β—葡萄糖苷酶酶活的影響。
    　1.4.3 正交分析
    　利用L9( 34 )正交試驗優化β—葡萄糖苷酶的發酵條件。
    　1.4.4 動力學研究
    　發酵過程中(zhong)，每隔(ge)24h分別測定發酵培養基中(zhong)Cx 酶、β—葡(pu)萄糖苷酶和(he)C1酶的(de)活(huo)性，分析β—葡(pu)萄糖苷酶酶活(huo)隨時間的(de)變化情況。

    　1.5 酶活力的測定
    　1.5.1 β—葡萄糖苷酶活力的測定。取4支洗凈烘干的10ml具塞刻度試管， 編號后各加入1.5ml0.5%水楊酸苷檸檬酸緩沖液，向1號試管中加入1.5mlDNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照，比色時調零用。將4支試管同時在50℃水浴中預熱5min—10min，再各加入酶液0.5ml，50℃水浴中保溫30min，取出后立即分別向2、3 和4號試管中加入1.5ml DNS 溶液以終止酶反應，充分搖勻后沸水浴5min，取出冷卻后用蒸餾水定容至10ml，充分混勻。
    　以1號試管溶液為空白對照調零點，測(ce)定2、3和4號試管液的(de)吸光度(du)值并記錄結果。定義(yi)在(zai)測(ce)定條件(jian)下，1min內水解水楊酸苷生成1μmol葡萄糖所需的(de)酶量為一(yi)個酶活單位（U）。

    　1.5.2 葡萄糖內切酶（CX）活力的測定 以羧甲基纖維素鈉為底物，方法同上。
    　1.5.3 葡萄糖外切酶（C1）活力的測定 以微晶纖維素為底物，方法同上。
    　1.5.4 還原(yuan)糖的(de)測定 采(cai)用DNS（3，5—二硝(xiao)基水楊酸）法。

    　2 結果與(yu)分(fen)析

    　2.1單因素分析
    　溫(wen)度是(shi)黑(hei)曲(qu)(qu)霉生(sheng)(sheng)長(chang)(chang)的(de)重要(yao)(yao)條(tiao)(tiao)件之一，它不僅影(ying)響著菌體(ti)的(de)生(sheng)(sheng)長(chang)(chang)速率，同時也(ye)制約著代謝產物的(de)水(shui)平。在30℃條(tiao)(tiao)件下(xia)，β—葡萄糖苷酶的(de)活力(li)最(zui)高，而40℃時酶活最(zui)低(di)。值得(de)注(zhu)意的(de)是(shi)，從培(pei)養基孢子生(sheng)(sheng)長(chang)(chang)情況上(shang)看，25℃條(tiao)(tiao)件下(xia)，黑(hei)曲(qu)(qu)霉產生(sheng)(sheng)的(de)孢子稀疏(shu)，主要(yao)(yao)以菌絲體(ti)為主；而在37℃條(tiao)(tiao)件下(xia)，孢子生(sheng)(sheng)長(chang)(chang)的(de)十分密(mi)集，但兩(liang)者β—葡萄糖苷酶的(de)酶活相(xiang)差不是(shi)很(hen)大。

    　這一現象表明，兩種產酶機制的不同，25℃更適合β—葡萄糖苷酶的生成，而37℃時，雖然產酶水平不高，但孢子數量巨大，產生的總酶活也高。
    　在固態發酵(jiao)中，初(chu)始含(han)水(shui)(shui)(shui)量主(zhu)要影響著(zhu)菌(jun)體對(dui)氧(yang)氣的(de)攝取(qu)。按料液比（培(pei)養(yang)(yang)基：水(shui)(shui)(shui)，g/ml）1：5配置(zhi)培(pei)養(yang)(yang)基的(de)初(chu)始含(han)水(shui)(shui)(shui)量時(shi)酶(mei)(mei)活最高(gao)。當含(han)水(shui)(shui)(shui)量過(guo)高(gao)時(shi)，由于限制了(le)培(pei)養(yang)(yang)基對(dui)氧(yang)的(de)攝取(qu)，產酶(mei)(mei)水(shui)(shui)(shui)平開始下降。

    　在一(yi)定范圍內，隨著接(jie)種(zhong)(zhong)量(liang)的(de)增大，酶活逐漸(jian)變大，當(dang)接(jie)種(zhong)(zhong)量(liang)增大到10%以(yi)上(shang)后，酶活變化減小，這可能是由于菌種(zhong)(zhong)數量(liang)過大，導致培養基營養成分的(de)迅速消耗，從而影響酶的(de)產量(liang)（見表2）。

    　2.2正交試驗優化發酵工藝
    　利用正交表(biao)設計L9（ 34 ）正交試(shi)驗, 溫度的三(san)個水(shui)平分(fen)(fen)別為25℃、30℃和(he)37℃；含(han)水(shui)量分(fen)(fen)別為1：1、1：3 和(he)1：5；接(jie)種量為2%、5%和(he)10%（見表(biao)1）。

    　可以(yi)看出, 在25℃、含水(shui)(shui)量1：5和(he)接種量10%的條件下(xia), 酶活(huo)(huo)達到(dao)10.85U / g；其中含水(shui)(shui)量對β—葡萄糖(tang)苷酶酶活(huo)(huo)具(ju)有顯著(zhu)的線型相關（ p< 0.05）。

　　2.3 葡萄糖苷酶的合成特性
    　葡(pu)萄(tao)糖(tang)苷(gan)酶(mei)是纖(xian)維素(su)酶(mei)的(de)重要組(zu)成(cheng)成(cheng)分，在(zai)很大程度上決定著纖(xian)維素(su)酶(mei)的(de)活性。以(yi)啤酒糟為培養基，在(zai)30℃，接種(zhong)量10%和料液比1：5的(de)條件下，利用(yong)固態發酵罐進行發酵，每隔24h測定黑曲霉(mei)產β—葡(pu)萄(tao)糖(tang)苷(gan)酶(mei)， 繪制各種(zhong)酶(mei)的(de)酶(mei)活變化曲線(xian)。

    　Cx酶(mei)(mei)(mei)(mei)在(zai)72h時達到產酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)高(gao)峰(feng)期(qi)，而β—葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)苷(gan)(gan)酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)酶(mei)(mei)(mei)(mei)活則繼續增(zeng)大(da)。在(zai)96h后(hou)(hou)，β—葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)苷(gan)(gan)酶(mei)(mei)(mei)(mei)酶(mei)(mei)(mei)(mei)活的(de)增(zeng)幅變(bian)小，這(zhe)一現象(xiang)可能說明，在(zai)96h時該(gai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)已經進(jin)入(ru)產酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)高(gao)峰(feng)期(qi)；此后(hou)(hou)，由(you)于(yu)(yu)菌絲體(ti)發(fa)生(sheng)自(zi)溶，胞內(nei)的(de)β—葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)苷(gan)(gan)酶(mei)(mei)(mei)(mei)釋(shi)放到培(pei)(pei)養基(ji)中，使酶(mei)(mei)(mei)(mei)活進(jin)一步變(bian)大(da)。利用啤酒糟作為培(pei)(pei)養基(ji)，β— 葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)苷(gan)(gan)酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)酶(mei)(mei)(mei)(mei)活要遠(yuan)高(gao)于(yu)(yu)Cx酶(mei)(mei)(mei)(mei)，而用其(qi)它(ta)培(pei)(pei)養基(ji)時，Cx酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)酶(mei)(mei)(mei)(mei)活要高(gao)于(yu)(yu)β—葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)苷(gan)(gan)酶(mei)(mei)(mei)(mei)，這(zhe)表明啤酒糟適合于(yu)(yu)β—葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)苷(gan)(gan)酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)發(fa)酵生(sheng)產。

    　3 結論

  ;  　目前，β—葡萄(tao)糖(tang)苷酶主(zhu)要是(shi)利用微生物發酵進行生產(chan)，尤其是(shi)黑曲霉(mei)和(he)米曲霉(mei)，培養基多為麩皮、蛋白胨(dong)和(he)各(ge)種無機鹽。

　　有研究表(biao)明(ming)，初始pH值對(dui)于(yu)β—葡萄糖苷酶的產量有著重要的影響。

    　啤(pi)酒糟富含各種營養成分，有利于誘導β—葡(pu)萄(tao)糖(tang)苷(gan)酶(mei)的(de)產生(sheng)，可能(neng)成為該酶(mei)發酵生(sheng)產的(de)天然培養基。實驗(yan)表明，在(zai)25℃，料液比1：5和(he)接種量10%的(de)固態發酵條件下(xia)，酶(mei)活可達(da)到(dao)10.85U / g；動力學(xue)研究顯示，β—葡(pu)萄(tao)糖(tang)苷(gan)酶(mei)在(zai)96h進入產酶(mei)高峰(feng)期，120h時達(da)到(dao)酶(mei)活最高值。此外，發酵后的(de)啤(pi)酒糟由于纖維結構被破壞(huai)，從(cong)而更(geng)容易被動物吸收，可能(neng)成為較(jiao)好(hao)的(de)有機(ji)飼料。