本(ben)文借(jie)鑒了一些植物多糖中(zhong)單糖組(zu)分的分析方法(fa)，采用氣相色譜法(fa)直接測(ce)定(ding)葡(pu)萄糖含(han)量，具有分析速(su)度快、選(xuan)擇性(xing)強、靈敏度高和測(ce)定(ding)結果精(jing)確可(ke)靠等優(you)點，從而為啤(pi)酒酵(jiao)母中(zhong)β—葡(pu)聚糖含(han)量的測(ce)定(ding)提供新參考。

    　1  材料與方法

    　1.1 材料與試劑

    　啤酒(jiu)酵(jiao)母廣州市(shi)珠江啤酒(jiu)廠(chang)；β—葡聚糖日本ADEKA株式會社；風味蛋(dan)白酶、Alcalase2.4L 諾維信公(gong)司(si)；丙酮(tong)、三氟乙(yi)(yi)酸(suan)、鹽酸(suan)羥胺、吡啶、乙(yi)(yi)酸(suan)酐等天津市(shi)化學試劑(ji)一廠(chang)，分(fen)析(xi)純；標準葡萄糖、甘露糖 上海源聚生物(wu)科技有限公(gong)司(si)，分(fen)析(xi)純。

    　1.2 .1儀器與設備

    　本(ben)實驗采用乙(yi)(yi)酰(xian)化(hua)作為(wei)(wei)衍生化(hua)方法，其反(fan)應原理(li)是：標準單糖和鹽酸(suan)羥胺在溶劑吡啶中加(jia)熱(re)反(fan)應生成糖肟，以乙(yi)(yi)酸(suan)酐作為(wei)(wei)乙(yi)(yi)酰(xian)化(hua)試劑，在加(jia)熱(re)條件下繼續(xu)反(fan)應，最后生成具有揮發性的糖腈乙(yi)(yi)酸(suan)酯(zhi)衍生物(wu)。

    　GC—2014 氣(qi)相色譜儀(yi)配備(bei)氫(qing)火焰離(li)子化(hua)檢測器(qi)FID ，日本(ben)島津(jin)公(gong)(gong)(gong)司(si)；KQ—250DE 型(xing)數控超聲清洗器(qi)，昆山市(shi)超聲儀(yi)儀(yi)器(qi)有限(xian)公(gong)(gong)(gong)司(si)；雷磁PHS—3C 精(jing)(jing)密pH 計(ji)，上(shang)海精(jing)(jing)科儀(yi)器(qi)有限(xian)公(gong)(gong)(gong)司(si)；N—EVAP111型(xing)氮吹(chui)儀(yi)，美(mei)國Organomation公(gong)(gong)(gong)司(si)；5804R型(xing)高(gao)速冷凍(dong)離(li)心機，德國Eppendorf 公(gong)(gong)(gong)司(si)；RE—52型(xing)旋轉蒸(zheng)發儀(yi)，上(shang)海亞榮生(sheng)化(hua)儀(yi)器(qi)廠(chang)；SHZ—D(III) 型(xing)循環水(shui)式真空泵，鞏義市(shi)予華儀(yi)器(qi)有限(xian)責任公(gong)(gong)(gong)司(si)；HHS型(xing)電熱恒溫水(shui)浴鍋，上(shang)海博迅實(shi)業有限(xian)公(gong)(gong)(gong)司(si)醫療設備(bei)廠(chang)。

    　1.2 .2β—葡聚(ju)糖的制(zhi)備

    　工藝流程：新鮮啤酒酵母→200目過篩除去啤酒花等雜質→水洗(xi)除去剩余啤酒→離(li)(li)(li)心(xin)分離(li)(li)(li)→將沉淀溶于水配成反應體系進(jin)行自溶→加鹽(yan)破壁→堿性蛋白酶酶解→離(li)(li)(li)心(xin)分離(li)(li)(li)→水洗(xi)沉淀→脫色(se)脫脂→冷凍干燥→粉(fen)碎(sui)→成品

    　操作要點：自溶，在(zai)(zai)pH7.0環境中，按反(fan)應體(ti)(ti)積(ji)1%的(de)量(liang)加入風味蛋白酶(mei)，50℃下(xia)(xia)反(fan)應24h；破壁，在(zai)(zai)pH10.5環境中，按反(fan)應體(ti)(ti)積(ji)3%的(de)量(liang)加入NaCl，攪拌(ban)混勻，80℃下(xia)(xia)保持1h；酶(mei)解，在(zai)(zai)pH10.5環境中，按反(fan)應體(ti)(ti)積(ji)1%的(de)量(liang)加入Alcalase2 .4L ，攪拌(ban)混勻，80℃下(xia)(xia)反(fan)應3h。

    　1.3.1β—葡聚糖(tang)和甘(gan)露聚糖(tang)的單糖(tang)含量(liang)分析(xi)

　　方(fang)法制備的(de)β—葡聚糖(tang)(tang)(tang)(tang)成品中(zhong)可能還有些其他物質(zhi)(zhi)，如甘露聚糖(tang)(tang)(tang)(tang)和蛋白(bai)質(zhi)(zhi)，其中(zhong)甘露聚糖(tang)(tang)(tang)(tang)是由甘露糖(tang)(tang)(tang)(tang)構成的(de)同一聚糖(tang)(tang)(tang)(tang)，本實驗同時測定甘露聚糖(tang)(tang)(tang)(tang)的(de)含量，為β—葡聚糖(tang)(tang)(tang)(tang)含量的(de)測定提供參考。

    　準確稱(cheng)取(qu)10mg 固體單糖標準品（先(xian)在105 ℃下烘干至恒重）、10mg 鹽酸羥胺于1.5mL小離(li)心管中，加(jia)(jia)入(ru)(ru)(ru)0.5mL吡啶，放(fang)入(ru)(ru)(ru)90℃水(shui)浴中加(jia)(jia)熱(re)反(fan)應30min，間歇振(zhen)蕩。取(qu)出后(hou)(hou)冷卻(que)至室溫，加(jia)(jia)入(ru)(ru)(ru)0.5mL乙酸酐，90℃下繼續水(shui)浴加(jia)(jia)熱(re)反(fan)應30min，離(li)心后(hou)(hou)取(qu)適量上清液直接進行(xing)氣相色譜(pu)分析。

    　1.3. 2 葡萄(tao)糖(tang)和甘露糖(tang)標準曲線(xian)的繪(hui)制

 &內(nei)容(rong)特征中華酒報nbsp;  　準(zhun)確(que)稱取標準(zhun)葡萄糖(tang)(tang)(tang)和(he)甘(gan)露糖(tang)(tang)(tang)各10mg，乙酰化后，葡萄糖(tang)(tang)(tang)和(he)甘(gan)露糖(tang)(tang)(tang)衍(yan)生(sheng)物濃(nong)(nong)度(du)同(tong)為(wei)10mg/mL，分(fen)別將此(ci)濃(nong)(nong)度(du)葡萄糖(tang)(tang)(tang)和(he)甘(gan)露糖(tang)(tang)(tang)衍(yan)生(sheng)物按比例混合(he)，配制成1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL和(he)5mg/mL的混合(he)糖(tang)(tang)(tang)液，同(tong)時(shi)做(zuo)空白對照，立即進行氣(qi)相色譜(pu)分(fen)析，記(ji)錄色譜(pu)峰面積，以其為(wei)縱坐標，并以混合(he)糖(tang)(tang)(tang)液中每種糖(tang)(tang)(tang)的濃(nong)(nong)度(du)為(wei)橫坐標，繪(hui)制標準(zhun)曲線。

    　1.3.3 啤酒酵母(mu)多糖的水(shui)解(jie)和衍生化準確稱取10mg多糖粉(fen)末于10mL離(li)心試管中(zhong)，加入(ru)2mL75%三(san)氟乙酸，封(feng)管，90℃下水(shui)浴3h，間歇振蕩，待(dai)酸水(shui)解(jie)完取出，將試管接入(ru)氮吹儀在80℃下蒸干，再加入(ru)1mL甲(jia)醇(chun)再次蒸干，重復3 次，以去(qu)除殘留三(san)氟乙酸。

    　1. 3.4 色(se)譜條件

    　氣(qi)相色(se)譜柱(zhu)：DB—17 石英毛細(xi)管柱(zhu)(30 m×0.32 mm，液(ye)膜厚(hou)0.25μm，Agilent) ；升(sheng)溫程序：初(chu)溫為160℃，以5℃/min 升(sheng)溫至(zhi)180℃，再以2℃/min 升(sheng)溫至(zhi)210℃，保留(liu)5min ；進(jin)樣口溫度：230℃，檢(jian)測器溫度：250℃；

    　載氣（氮氣）流(liu)(liu)速(su)(su)：20mL/min，氫氣流(liu)(liu)速(su)(su)：45mL/min，空氣流(liu)(liu)速(su)(su)：400mL/min；分流(liu)(liu)比(bi)20：1，進樣(yang)量1μL。

    　乙酰化后，標(biao)準葡(pu)萄糖(tang)和甘(gan)露糖(tang)衍生(sheng)物的氣(qi)相色譜分(fen)析結(jie)果如圖1 所示，分(fen)析表明采(cai)用(yong)糖(tang)腈乙酸酯(zhi)衍生(sheng)化的方法，一種單糖(tang)只對應一種衍生(sheng)化產物，在較低的200 ℃下即可分(fen)離出(chu)來。

    　兩(liang)種標準單(dan)糖衍生(sheng)物(wu)保留時間分別(bie)為(wei)14.347min和15.016min，分析表明在1. 3.4 所采用的(de)(de)氣相(xiang)色譜條(tiao)件下(xia)，混合(he)單(dan)糖中的(de)(de)兩(liang)種單(dan)糖出峰時間短(duan)，峰形對(dui)稱，隔(ge)得較開，并未(wei)出現拖(tuo)尾現象。

　　2  實驗分(fen)析

   ; 　2 .1 兩種標準(zhun)單(dan)糖衍生物(wu)的標準(zhun)曲線

    　葡萄糖衍生物標(biao)準曲線(xian)（見圖(tu)1 ），甘露糖衍生物標(biao)準曲線(xian)（見圖(tu)2）。

　
    　根(gen)據標(biao)準(zhun)葡萄糖和甘(gan)露(lu)糖衍(yan)生物標(biao)準(zhun)曲線(xian)繪(hui)制的(de)操作步驟。從曲線(xian)趨勢來看(kan)，兩種單糖衍(yan)生物出峰面積隨著(zhu)糖濃度的(de)增大而呈(cheng)線(xian)性增長。

    　2 .2 樣品水解單糖乙酰化(hua)產物的氣相(xiang)色譜分析

    　ADEKA 株(zhu)式會社是日本(ben)最大的(de)(de)β—葡(pu)(pu)聚(ju)(ju)糖生產(chan)(chan)公司(si)，這里將其進口(kou)產(chan)(chan)品(pin)與(yu)本(ben)實驗室制備的(de)(de)成品(pin)中葡(pu)(pu)聚(ju)(ju)糖和甘露聚(ju)(ju)糖含(han)量進行比較，將兩(liang)(liang)種樣品(pin)水(shui)(shui)解(jie)(jie)并乙酰化后，按與(yu)混(hun)合標樣相(xiang)同的(de)(de)色譜(pu)分(fen)(fen)析(xi)(xi)條(tiao)件進行氣(qi)相(xiang)色譜(pu)分(fen)(fen)析(xi)(xi)，結果分(fen)(fen)別如圖4 和圖5 所示(shi)，其水(shui)(shui)解(jie)(jie)單糖保留(liu)時間與(yu)標準(zhun)混(hun)合單糖的(de)(de)保留(liu)時間對比分(fen)(fen)析(xi)(xi)表(biao)明(ming)，水(shui)(shui)解(jie)(jie)后的(de)(de)兩(liang)(liang)種單糖分(fen)(fen)別為葡(pu)(pu)萄糖和甘露糖，其中葡(pu)(pu)萄糖含(han)量較高。β—葡(pu)(pu)聚(ju)(ju)糖水(shui)(shui)解(jie)(jie)衍生化氣(qi)相(xiang)色譜(pu)圖（見(jian)圖3）。

    　2 .3 啤酒酵母中β—葡聚糖(tang)和甘露聚糖(tang)的(de)含量(liang)計算

    　根據樣(yang)品中(zhong)水解后每種(zhong)單糖(tang)氣相(xiang)分析的(de)峰面積，代入葡(pu)萄糖(tang)和甘(gan)露(lu)糖(tang)的(de)標(biao)準曲(qu)線，可算(suan)出葡(pu)萄糖(tang)和甘(gan)露(lu)糖(tang)的(de)濃度，進一步計算(suan)出樣(yang)品中(zhong)葡(pu)萄糖(tang)和甘(gan)露(lu)糖(tang)含(han)量(liang)，從而(er)最(zui)終得到β—葡(pu)聚糖(tang)和甘(gan)露(lu)聚糖(tang)的(de)含(han)量(liang)，所有(you)計算(suan)結果（見表(biao)1）。

    　從表1可(ke)以(yi)看出， 實(shi)驗室制備的β—葡聚(ju)糖(tang)和甘露聚(ju)糖(tang)與日本進(jin)口β—葡聚(ju)糖(tang)的含量(liang)都(dou)比(bi)較接近。樣品中組分(fen)測定的重現性實(shi)驗結果（見表2 ）。

    　根據2.3測(ce)定的結果， 每10mg 樣品中β—葡聚糖和甘(gan)露聚糖含量分別為3.239mg和1.682mg，分別添(tian)加(jia)(jia)5mg葡萄糖和甘(gan)露糖進行測(ce)定，結果如表(biao)3所示，加(jia)(jia)標回收率(lv)為87.14%—101.2%，說明該方(fang)法準確性高， 能(neng)夠滿(man)足檢(jian)測(ce)要求。樣品中組(zu)分的回收率(lv)實驗結果（見表(biao)3 ）。

    　3  結論

    　本實驗(yan)建立的啤酒酵(jiao)母β—葡(pu)聚糖含(han)量的氣相(xiang)色譜測(ce)定法，前處(chu)理簡單(dan)、操作方(fang)便、重現性好(hao)、選擇性強、精(jing)密度(du)高，符合實驗(yan)室對(dui)β—葡(pu)聚糖含(han)量測(ce)定方(fang)法的要求。

　　在這(zhe)個分(fen)析過程(cheng)中，要(yao)注意： 

　　第(di)一(yi)，糖(tang)類(lei)衍生化方法要(yao)求制備簡(jian)便、試劑易得(de)，而且每種(zhong)單(dan)糖(tang)要(yao)得(de)到單(dan)一(yi)的(de)色譜(pu)峰，這對單(dan)糖(tang)的(de)定量分(fen)(fen)析是(shi)十分(fen)(fen)重要(yao)的(de)；第(di)二，色譜(pu)柱(zhu)對于分(fen)(fen)離效果(guo)也很(hen)重要(yao)，在氣(qi)相條件探索(suo)過程中，比(bi)較了AC—5（非極性(xing)）和DB—17（中極性(xing)）兩種(zhong)毛細管色譜(pu)柱(zhu)，發現AC-5 出(chu)峰慢(man)，分(fen)(fen)離不徹底，而DB—17 在較低溫(wen)度下很(hen)快就能出(chu)峰，而且不同單(dan)糖(tang)峰形(xing)對稱，分(fen)(fen)隔較開，效果(guo)很(hen)好，于是(shi)選擇DB—17作為分(fen)(fen)析色譜(pu)柱(zhu)。