為了得到發(fa)(fa)酵石榴(liu)汁的(de)優良(liang)菌(jun)種(zhong)，并確定(ding)石榴(liu)酒(jiu)發(fa)(fa)酵的(de)工藝參數(shu)，從自然發(fa)(fa)酵的(de)石榴(liu)酒(jiu)醪(lao)中分(fen)離、純化(hua)石榴(liu)酒(jiu)酵母菌(jun)種(zhong)；通過單因素和正交試(shi)驗，確定(ding)石榴(liu)酒(jiu)發(fa)(fa)酵的(de)工藝參數(shu)。

　　結果發(fa)現，分離純化的(de)(de)菌種經形態特征(zheng)和26S rDNA D1/D2 區域(yu)序(xu)列(lie)分析鑒定為(wei)(wei)釀酒(jiu)酵(jiao)(jiao)母。由(you)此確定的(de)(de)最佳工藝條件為(wei)(wei)：溫度(du)28℃、pH 3.8、糖(tang)度(du)為(wei)(wei)17%、二氧化硫的(de)(de)添加量(liang)為(wei)(wei)100 mg/L，最終發(fa)酵(jiao)(jiao)的(de)(de)石(shi)榴酒(jiu)的(de)(de)酒(jiu)度(du)在10%VoL左右。

    　石榴(liu)酒是以石榴(liu)為原(yuan)料，經剝皮、榨汁、發酵、澄清、陳(chen)釀而成(cheng)的果酒。其色(se)澤光亮透明，酒體(ti)純正，酸甜爽口，保(bao)留了石榴(liu)酸、甜、澀、鮮之天然風味，含有(you)大量(liang)氨基(ji)酸、多(duo)種維生素等，具有(you)很高的營養價(jia)值，并有(you)生津化食、健脾益胃、降壓降脂、軟化血(xue)管、保(bao)健美容及止瀉之功效(xiao)。

　　經發酵過的(de)石(shi)(shi)榴(liu)汁(zhi)抗氧化活性與丁基羧(suo)基茴(hui)香醚(mi)（BHA）相近，明顯高于紅葡(pu)萄(tao)酒。中(zhong)國(guo)石(shi)(shi)榴(liu)種植面積(ji)迅速擴大(da)(da)，尤其(qi)是(shi)河南(nan)滎陽、衛輝等地(di)形(xing)成了大(da)(da)的(de)石(shi)(shi)榴(liu)園(yuan)，產量已具規模，但是(shi)石(shi)(shi)榴(liu)不(bu)耐儲藏，除鮮食外(wai)，每(mei)年都有許多(duo)果(guo)實(shi)因(yin)不(bu)能及時消費(fei)和(he)加工而浪費(fei)，特別是(shi)小(xiao)果(guo)和(he)裂果(guo)。

    　近年來，從天然石(shi)(shi)(shi)榴(liu)(liu)汁中分離得到了(le)一株(zhu)高(gao)效發酵(jiao)石(shi)(shi)(shi)榴(liu)(liu)酒(jiu)的菌株(zhu)，通過形態(tai)特征和26S rDNAD1/D2 區域(yu)序列(lie)分析鑒定為(wei)釀酒(jiu)酵(jiao)母系列(lie)。對(dui)其發酵(jiao)工藝(yi)參(can)數進行優化，獲(huo)得了(le)酒(jiu)體純(chun)正生物功效高(gao)的石(shi)(shi)(shi)榴(liu)(liu)酒(jiu)生產(chan)最佳工藝(yi)，并探討了(le)石(shi)(shi)(shi)榴(liu)(liu)的綜合利用，增(zeng)加了(le)石(shi)(shi)(shi)榴(liu)(liu)及其他相關農產(chan)品的附加值。對(dui)提高(gao)石(shi)(shi)(shi)榴(liu)(liu)經濟效益，保護(hu)和發展(zhan)石(shi)(shi)(shi)榴(liu)(liu)產(chan)業有(you)著非常(chang)重要的意義。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

    　石(shi)(shi)榴(liu)：購自(zi)河南省新鄉(xiang)市(shi)衛輝(hui)。菌(jun)種：從石(shi)(shi)榴(liu)汁自(zi)然發酵(jiao)(jiao)醪中分離。分離及保藏(zang)培養(yang)基(ji)：馬鈴(ling)薯20%，蔗糖1%，石(shi)(shi)榴(liu)汁40%，瓊脂2%。菌(jun)種鑒(jian)定材料：引物(wu)(wu)NL1（5’—GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG—3’）和NL4（5’—GGT CCG TGT TTC AAG ACG G—3’），由(you)上海(hai)生工(gong)生物(wu)(wu)工(gong)程(cheng)技術服務有(you)(you)限公司(si)合成。酵(jiao)(jiao)母基(ji)因組DNA提取試劑盒（Solarbio 公司(si)），PCR buffer、Tag 酶、dNTP（寶生物(wu)(wu)工(gong)程(cheng)（大連(lian)）有(you)(you)限公司(si)）。

    　1.2 主(zhu)要儀器

    　PCR儀為(wei)T—Gradient （德國(guo)Biometra公司(si)）。

    　1.3 方(fang)法

    　1.3.1 菌源的制備取壓榨好的石(shi)榴(liu)全(quan)汁(zhi)置(zhi)室溫(wen)進(jin)行自然發(fa)酵，使石(shi)榴(liu)汁(zhi)內的酵母大量繁殖，待(dai)有大量氣泡并(bing)有較濃酒味產生時(shi)，即(ji)可供分離石(shi)榴(liu)酒菌源。

    　1.3.2 菌種的(de)分離(li)、純化取上述(shu)發酵好的(de)石(shi)榴酒醪進行梯(ti)度稀釋(shi)，均勻(yun)涂布(bu)至分離(li)用(yong)的(de)瓊脂(zhi)培養(yang)基上，22℃—24℃恒溫培養(yang)36h，挑單菌落(luo)培養(yang)直(zhi)至純化。

    　1.3.3 菌種的(de)(de)鑒(jian)定純化后的(de)(de)菌株(zhu)經菌落(luo)形(xing)態觀(guan)察和鏡檢，初(chu)步確定為酵(jiao)母菌。同時，根據酵(jiao)母菌分(fen)類學研(yan)究標準(zhun)方法做分(fen)子(zi)鑒(jian)定。酵(jiao)母核基因組(zu)的(de)(de)提取使(shi)用酵(jiao)母基因組(zu)DNA提取試劑盒，按(an)照(zhao)說明書操作。

　　使用(yong)引物NL1和(he)NL4進行(xing)26S rDNA D1/D2區的擴增。PCR 反應液的組成（采用(yong)50μL體系(xi)）：每(mei)管中含PCR緩沖液（10×）5.0μL；25mmol/LMgCl2 3.0μL；10mmol/LdNTP1.0μL；10μmol/LNL1 和(he)NL4 各1ul；0.5 U/ul DNA 聚(ju)合酶(mei)0.3 μL；10ng/ul —1000ng/ul 模板(ban)DNA1.0μL；最后添加ddH2O 定容50μL。PCR循環(huan)(huan)次(ci)序(xu)為：95℃預變(bian)性5min，94℃變(bian)性1min，52℃退火1min，72℃延(yan)伸1min20s；循環(huan)(huan)36次(ci)；再72℃延(yan)伸8 min。PCR產物經(jing)1%瓊脂(zhi)糖凝膠(jiao)電泳檢(jian)測(ce)后，由英俊生物技(ji)術有限公(gong)司測(ce)序(xu)。

    　1.3.4 發酵工藝的確定

       發酵溫度的確定。
　　將(jiang)石榴(liu)汁(zhi)的糖度(du)(du)調整為(wei)19%，pH調為(wei)4.0，添(tian)加SO2量為(wei)80mg/L。接種等量的石榴(liu)酒(jiu)酵母，分(fen)別置(zhi)于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃5個(ge)溫度(du)(du)梯度(du)(du)下(xia)培養。待(dai)不再(zai)有氣(qi)泡產生(sheng)時停止發酵，用來測定其殘(can)糖和酒(jiu)精度(du)(du)。

    　發酵pH的(de)確(que)定。

　　將石(shi)(shi)榴(liu)汁的糖度通過添加(jia)蔗糖調整為(wei)19%，添加(jia)SO2量為(wei)80mg/L，調pH分別為(wei)3.8、4.1、4.4、4.6、4.8，接種等(deng)量的石(shi)(shi)榴(liu)酒酵(jiao)母，置(zhi)于28℃下發(fa)酵(jiao)。待不再產生氣泡時(shi)停(ting)止(zhi)發(fa)酵(jiao)，測定其殘糖和酒精度。

    　不同糖濃度(du)發酵的試驗。

　　利用(yong)蔗糖(tang)(tang)，將(jiang)石(shi)榴汁的糖(tang)(tang)度(du)(du)(du)分別(bie)調整(zheng)為13%好的文章種(zhong)類神州酒(jiu)報、15%、17%、19%、21%5個梯(ti)度(du)(du)(du)，添加(jia)SO2量為80mg/L，調節(jie)pH為4.0，接種(zhong)等量的石(shi)榴酒(jiu)酵(jiao)(jiao)(jiao)母。置于28℃下發酵(jiao)(jiao)(jiao)。待不再產(chan)生氣泡時停(ting)止發酵(jiao)(jiao)(jiao)，測定其殘糖(tang)(tang)和酒(jiu)精度(du)(du)(du)。

　　SO₂添加量的確定。

　　將石榴汁糖度調整為19%，pH調為4.0，分別選擇SO2的添加量為40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L。接種等量石榴酒酵母，置于28℃下發酵。待不再產生氣泡時停止發酵，測定其殘糖和酒精度。正交試驗因素水平測試。以溫度、pH、糖度、SO₂的添加量(liang)為(wei)因素，進行L9（34）正交試驗（見(jian)表1），以確定各因素的最佳(jia)用(yong)量(liang)。

　　2 結果與分析

　　2.1 石榴酒酵母的分離鑒定

　　從(cong)自(zi)然(ran)發酵的(de)石榴(liu)酒醪中(zhong)分離(li)出(chu)的(de)酵母的(de)菌落(luo)形態可以看出(chu)，所(suo)分離(li)菌種的(de)菌落(luo)形態特征為：菌落(luo)乳白色，圓(yuan)形較(jiao)大，中(zhong)間突(tu)起，濕潤有光澤(ze)，邊緣成浸潤狀。經鏡檢其細(xi)胞為橢(tuo)圓(yuan)型，能進(jin)行(xing)出(chu)芽繁(fan)殖，符合(he)果酒酵母的(de)典型特征。

　　經(jing)BLAST分析(xi)及序列相似性計算(suan)，所分離出(chu)的被測菌(jun)株的26S rRNAD1/D2 區基因序列與模式菌(jun)株（U44806）同源性為(wei)99.4%，被鑒定為(wei)釀酒酵母。

　　2.2 發酵條件單因素(su)試驗(yan)結果

　　在(zai)適宜的(de)溫度(du)(du)、pH、糖(tang)濃度(du)(du)下，酵母菌(jun)的(de)生(sheng)長繁殖和代謝速度(du)(du)都很迅(xun)速，較低的(de)pH還可以(yi)保(bao)證添加的(de)SO2以(yi)較多的(de)游離態存在(zai)，更好(hao)地(di)起(qi)到(dao)抑制有害微生(sheng)物的(de)作用(yong)。因此，試(shi)驗對(dui)上(shang)述參(can)數進(jin)行了單(dan)因素試(shi)驗。

    　通(tong)過發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)過程觀察發(fa)(fa)(fa)現，發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)溫度高，發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)完成快，殘糖(tang)高，酒(jiu)精度低，果酒(jiu)風(feng)味不足；發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)溫度低，發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)完成較(jiao)慢，殘糖(tang)低，酒(jiu)精度也高。

　　從不同溫度(du)下(xia)發(fa)酵樣品的殘糖(tang)和酒精度(du)結果來看，26℃是最適(shi)的發(fa)酵溫度(du)。

　　由(you)(you)不(bu)(bu)同(tong)(tong)pH下發酵(jiao)樣品的(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)糖(tang)(tang)和酒(jiu)精(jing)度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)結果可(ke)以看出(chu)(chu)，不(bu)(bu)同(tong)(tong)pH對(dui)石(shi)榴酒(jiu)發酵(jiao)結束的(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)糖(tang)(tang)幾乎沒有(you)影(ying)響，在pH4.6時(shi)殘(can)糖(tang)(tang)較低，但酒(jiu)精(jing)度(du)也低。在pH3.8時(shi)產(chan)酒(jiu)精(jing)度(du)最高，在pH超過4.4時(shi)雖然也能達到相同(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)酒(jiu)精(jing)度(du)，但發酵(jiao)后石(shi)榴酒(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)顏色發黃，失(shi)去了原本的(de)(de)(de)(de)(de)深紅色，影(ying)響石(shi)榴酒(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)外觀(guan)效果。因此(ci)，確(que)定石(shi)榴酒(jiu)酵(jiao)母發酵(jiao)的(de)(de)(de)(de)(de)最適為pH3.8。由(you)(you)不(bu)(bu)同(tong)(tong)糖(tang)(tang)濃(nong)度(du)下發酵(jiao)的(de)(de)(de)(de)(de)樣品的(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)糖(tang)(tang)和酒(jiu)精(jing)度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)結果可(ke)以看出(chu)(chu)，隨(sui)著發酵(jiao)初糖(tang)(tang)的(de)(de)(de)(de)(de)提高，發酵(jiao)結束時(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)糖(tang)(tang)也隨(sui)之增(zeng)加，而最終酒(jiu)精(jing)度(du)也逐漸隨(sui)之增(zeng)加，在糖(tang)(tang)度(du)為19%時(shi)達到最大，而后又開始(shi)下降。

    　因(yin)此，并不是糖(tang)(tang)(tang)度(du)越高，酒精的轉(zhuan)化率就越高，過(guo)高的糖(tang)(tang)(tang)度(du)可能會(hui)抑制酵母菌(jun)對糖(tang)(tang)(tang)的利用。這可能是糖(tang)(tang)(tang)度(du)過(guo)高時，酵母菌(jun)所(suo)處(chu)環境的滲透壓超出了(le)其(qi)所(suo)耐受的能力(li)，從而抑制了(le)其(qi)生理活動。

　　從試驗結果來看，石榴酒酵母發酵的最適糖度為19%。在果酒釀造過程中都會添加一定量的SO₂，起到抑制雜菌、護色、澄清、增酸和改善口味等作用。但添加過多會影響酒的風味、抑制酵母菌的發酵及出現酒液中殘留硫量超標等危害。由SO₂對石榴酒發酵結束的殘糖和酒精度的影響可看出，SO₂對石榴酒發酵結束時(shi)的殘(can)糖濃度幾乎(hu)沒有影響(xiang)，對最終(zhong)酒精度的影響(xiang)也(ye)較小，均為(wei)(wei)6%左右，而添加量為(wei)(wei)80mg/L 時(shi)酒精度稍(shao)高(gao)一點(dian)，為(wei)(wei)6.1%。

    　2.3 正交試驗結果

    　發酵溫度(du)、pH、糖度(du)（%）和SO2的添(tian)加量（mg/L）4因素正(zheng)交試驗結(jie)果見(jian)表2。

　　由表2 可以看出，對酒精度影響程度的主次順序為糖度（C）＞ 溫度（A）＞pH（B）＞SO2的添加量（D），即糖度、溫度和pH 對石榴果酒的酒精度影響較大，而SO2的添加量對石榴酒酵母發酵的影響較小，其最優方案為A₂B₁C₁D₃，即溫度為28℃，pH為3.8，糖度為17%，SO₂的添加量為100mg/L時，石榴酒酵(jiao)母(mu)發酵(jiao)石榴汁產酒度最好。

    　3 結論

    　研究從自(zi)然發酵的石榴酒(jiu)醪里(li)分離出了(le)一株能高(gao)效發酵石榴汁的酵母(mu)菌種(zhong)，通過基因(yin)組分析初步鑒定為釀酒(jiu)酵母(mu)。

　　通過(guo)正交(jiao)優化試驗，獲(huo)得(de)了最佳(jia)石榴酒(jiu)釀造條(tiao)件，并確定了釀造過(guo)程中(zhong)影響(xiang)酒(jiu)精度(du)因素為糖度(du)＞溫(wen)度(du)＞pH＞二氧化硫添加量。

　　石(shi)榴酒(jiu)艷若(ruo)朝霞，果香純正，優(you)雅，更因其獨(du)特的食療保健作用(yong)，極(ji)具發(fa)(fa)展(zhan)潛(qian)力，發(fa)(fa)展(zhan)果酒(jiu)符(fu)合國家(jia)產(chan)業政策的要(yao)(yao)求(qiu)。而做好研究為石(shi)榴酒(jiu)規(gui)模生產(chan)提(ti)供了重要(yao)(yao)參考(kao)。大(da)力發(fa)(fa)展(zhan)石(shi)榴果樹栽培，選(xuan)育(yu)優(you)良(liang)品種，對開(kai)發(fa)(fa)石(shi)榴酒(jiu)等系列產(chan)品很重要(yao)(yao)。